【货号】 BC-C-RA-013

【规格】 1*10⁶个/T25培养瓶（或冻存管）

【保存】 液氮保存，长期

【产品介绍】

【操作步骤】

【细胞复苏】

1、取出1mL冻存管后，迅速放入37℃水浴锅中不断摇晃使其解冻，直至冻存管中无结晶（此过程尽量在2min内完成）；

2、准备15mL离心管，加入2-6mL完培，将冻存管中的细胞悬液移至离心管，1000 rpm离心3~5min；（比较难养的细胞可适量增加离心管中的完培）

3、吸弃上清，用新鲜培养基重悬细胞，接种至无菌的培养器皿中，轻晃动混匀后放入37℃、5%CO₂细胞培养箱中培养。

注：复苏第二天若细胞状态较好，但漂浮碎片较多可做换液处理；

复苏的细胞需要时间恢复状态，当复苏好后密度低于80%时，2天内暂时不要换液，细胞生长状态恢复后再进行后续传代等操作；

【细胞传代】

当细胞汇合度达到80%-90%，即可传代培养。

收集细胞：贴壁细胞可以参考以下方法1、吸去培养液，加入不含钙镁的PBS，轻轻润洗瓶底1-2次，吸弃PBS；2、加入0.25%胰酶-EDTA消化液（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），铺匀瓶底放入培养箱中消化1-2min；（部分细胞贴壁较牢，可采用分步消化：将消化下来的细胞转移至离心管终止，在培养瓶中加入胰酶继续消化，直至大部分细胞脱落）3、倒置显微镜下观察大部分细胞变圆脱落，迅速加入完全培养基终止消化，完培与胰酶比例为2:1；4、轻轻吹打细胞后吸出转移至离心管中。半贴壁半悬浮细胞需先收集悬液至离心管再参考贴壁细胞操作。

离心：收集好的细胞在1000rpm条件下离心3~5min，离心好后弃除上清液。

接种：准备好新的培养瓶并添加适量完全培养基，在离心管加入1-2mL完全培养基重悬吹打均匀，初次传代将细胞悬液按1:2比例接种到新的培养瓶中，后续可根据细胞实际情况按1:2-1:4的比例传代；接种完成后放入37℃、5%CO₂细胞培养箱中培养。

悬浮细胞建议采用半换液传代：将培养瓶站立静置5-10min，肉眼可见细胞沉底，吸取1/2~2/3上清至离心管离心，将瓶内剩余悬液按1:2或1:3的比例转移至新的培养瓶，将离心管中的细胞重悬后放入培养瓶添加新鲜完全培养基即可。

【细胞冻存】

收集细胞参考细胞传代步骤。

冻存液重悬：细胞按照传代步骤收集细胞至离心管并计数，根据计数的密度决定细胞冻存数量，一般推荐细胞冻存密度为1×10⁶-1×10⁷个活细胞/管。离心后弃上清，加入配制好的冻存液重悬，分配到冻存管中，每管1mL。

冻存：将冻存管放入程序降温盒中进行梯度降温，然后放入-80℃冰箱降温，24h后将冻存管转入液氮罐中。若没有冻存盒，可于冰箱4℃放置30min，随后转移至-20℃冷冻2h，接下来将其放于-80℃超低温冰箱中过夜，最终放置于液氮中以长期保存。

【注意事项】

（1）所有动物细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全柜内操作，并注意防护。所有废液及接触过此细胞的器皿需灭菌后方能丢弃。

（2）若细胞在操作过程中发生污染，需对污染的细胞进行灭活方可丢弃。

（3）本库的细胞系（株）仅用于科研工作，未经许可不得用于其他目的，使用者不得将本库细胞系（株）转让给第三者。

（4）细胞到货后建议在前3代时冻存一批细胞种子以备后续用。