【货号】 BL-301

【规格】 100mL

【保存】 -20℃，12个月。

【产品简介】

外源基因导入真核细胞的方法有很多种，如磷酸钙转染法、DEAE-葡聚糖转染法、脂质体法、电穿孔法、显微注射法等。2×HEPES缓冲盐溶液主要用于磷酸钙转染，其主要成分为HEPES，HEPES是一种非离子两性缓冲剂，能有效控制pH在6.8~8.2范围，尤其在pH7.2~7.4具有较好的缓冲能力，终浓度一般为10~50mmol/L，培养液内含20mmol/L HEPES即可达到较好的缓冲能力。

HEPES缓冲盐溶液(2×HeBS)是一种常用的细胞转染溶液，主要由HEPES、氯化钠、磷酸盐等组成，其最适pH值为7.05~7.12，经过滤除菌处理。影响磷酸钙转染效率的因素主要有沉淀中DNA含量、DNA在细胞上停留的时间、休克时间。2×HeBS要求DNA浓度在10~50μg为宜，Hela、BALB等细胞沉淀放置16h，CHO、DUKX、BⅡ等细胞可以通过甘油、DMSO进行热休克处理以提高转染效率。

【自备材料】

1、胰蛋白酶消化液

2、PBS

3、无菌水

4、CaCl2溶液

5、甘油或DMSO

6、筛选药物

 

【使用方法】

1、在转染前24h用蛋白酶消化培养细胞，取适量数期细胞转移至新的培养器皿中，使细胞在转染时生长状态良好。

2、在加入DNA之前2~4h，按9mL/10cm培养皿的比例加入完全培养液，置于37℃ 5% CO2培养箱培养。

3、取适量乙醇沉淀的DNA溶解于450μl无菌水中，加入50μl 2.5M CaCl2，并充分混匀，使Ca2+终浓度达到0.25M。

4、用移液器一边吹打2×HeBS，一边逐滴加入配制好的DNA/CaCl2溶液(操作应迅速，一般在30~60s)，并剧烈振荡5s，室温下静置20~30min以形成沉淀。

5、取沉淀均匀加入到培养皿细胞中，轻轻晃动使沉淀于培养液充分混匀，置于37℃ 5% CO2培养箱培养4~16h。如果培养细胞为CHO、DUKX等，可以DMSO或甘油进行休克处理，转染效率会大大增加。即培养4~6h后，用2ml含10%甘油或20% DMSO的完全培养液替换当前培养液，室温下静置3min，加5ml PBS摇动混匀。

6、去除培养液，用PBS清洗细胞2次，加入5~10mL完全培养液继续培养。

7、对于瞬时转染，在转染的不同时间点内收集细胞并检测，一般时间多控制在12~60h以内。

8、对于稳定转染，转染后在非选择性培养液培养18~48h，一般时间多控制在24~36h，以便外源基因表达。

9、用胰蛋白酶消化细胞并传代，更换适当的选择培养液继续培养，每2~4d更换一次选择培养液，一般10~14d会出现目的细胞克隆。

【注意事项】

1、注意无菌操作，尽量避免污染。

2、对于瞬时转染，可以不用乙醇沉淀的DNA。

3、休克处理某些细胞系会使转染效率大大提高，但应注意甘油暴露过久易导致细胞死亡。

4、转染12~24h后，可以加入终浓度为10mmol/L的丁酸钠溶液，可以提高病毒滴度。

5、该试剂用于转染时应检测其转染效率，好的转染效率应介于30~60%之间。

6、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。